Eppendorf Eporator - Handbuch (Seite 17)

Bedienung
Eppendorf Eporator®
Deutsch (DE)
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• DNA-Konzentration: Die Konzentration der DNA kann die Transformationseffizienz
erheblich beeinflussen.
• Häufigkeit und Effizienz: Die Häufigkeit ist definiert als die Zahl der Transformanden
pro überlebende Zellen. Die Effizienz ist definiert als Transformanden pro μg DNA.
Wenn Sie hohe DNA-Konzentrationen einsetzen, können Sie eine hohe Häufigkeit
erzielen. Hohe Effizienz erzielen Sie, wenn Sie eine hohe Zellkonzentration einsetzen.
Die Verringerung der DNA-Konzentration ist hilfreich um Co-Transformationen der
gleichen Zelle zu vermeiden.
5.2.2 Elektroporationsmedium
• Empfindlichkeit der Zellen: Da die Elektroporation temporäre Poren in den
Zellmembranen hervorruft, sind die Zellen gegenüber äußeren Einflüssen empfindlich.
• Elektrolyse des Mediums: Während der Elektroporation beeinflusst die Elektrolyse
des Mediums die Eigenschaften des Mediums erheblich (z.B. den pH-Wert). Viele
Zellen können absterben, wenn nicht sofort nach der Elektroporation frisches Medium
zur Erholung der Zellen zugegeben wird (siehe Regeneration der Zellen auf S. 20).
• Ionenstärke des Mediums: Bei der Elektroporation von Zellen muss die Ionenstärke
des Mediums berücksichtigt werden. Um den Widerstand des Mediums so hoch wie
möglich zu halten, müssen Sie Salze aus den Zell- und DNA-Präparationen entfernen.
Rest-Ionen in der Zellsuspension stammen oft aus dem Kulturmedium. Sie erreichen
eine höhere Transformationseffizienz, wenn Sie die Salze sowohl aus der DNA-Lösung
als auch aus den Zellpräparationen entfernen. Im allgemeinen ist die geringstmögliche
ionische Lösung, der die Zellen noch standhalten, zu bevorzugen.
5.2.3 Wachstum und Aufbereitung von Zellen
• Wachstumsphase der Zellen: Setzen Sie Bakterienstämme, beispielsweise von E. coli,
die zur Elektroporation mit maximaler Effizienz verwendet werden sollen, während der
exponentiellen Wachstumsphase ein.
• Aufbereitung der Zellen: Waschen Sie die Zellen gründlich, damit das
Wachstumsmedium, das die Elektrokompetenz beeinflusst, entfernt wird.
• Konzentration der Zellen: Setzen Sie eine finale Konzentration der Zellen von etwa
1-3 x 10 11 Zellen/mL ein. Wird dieser Wert überschritten, so kann die Homogenität des
elektrischen Feldes beeinflusst werden.
• Bedingungen für eine Elektroporation: Jeder Bakterien- oder Hefestamm hat
optimale Bedingungen, die empirisch ermittelt werden müssen. Diese Bedingungen
umfassen:
– Das Zellvolumen
– Die Menge der spezifischen Plasmide
– Die eingesetzte Feldstärke (E). Im allgemeinen ist zum Erreichen einer maximalen
Transformationsleistung für E. coli eine Feldstärke von 12-19 kV/cm erforderlich.
Die Feldstärke berechnet sich aus der eingesetzten Spannung und dem Abstand der
Elektroden (E = V/cm).