Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 10)

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Die minimale Pulsspannung ist sowohl abhängig vom Zelldurchmesser nach der Inkubation im Elektroporationspuffer als
auch von der Temperatur und der Spaltbreite der Küvetten. Die angegebenen Werte können dazu benutzt werden, um
die ideale Pulsspannung, die am Gerät eingestellt werden muss, zu bestimmen (siehe Kapitel 3.1).
Beispiel
Zelltyp: Suspensionszellen
Zelldurchmesser im Elektroporationsmedium: ~ 20 µm
Elektrodenabstand in der Küvette: 2 mm
Temperatur in der Küvette: Raumtemperatur
Durchbruchspannung gemäß der Diagramme: ~ 130 V
Versuchsreihe zur Optimierung der Pulsspannung: 130 V / 260 V / 390 V
Die Dauer des Pulses ist neben der Feldstärke ein weiterer wesentlicher Faktor für eine erfolgreiche Transfektion.
Die Dauer des Pulses hängt in erster Linie vom Durchmesser der Zelle ab. Je größer die Zelle ist desto länger muss die
Dauer des Pulses gewählt werden, um das Durchbruchspotential der Membran zu erreichen.
Empirisch haben sich für Elektroporationen bei Raumtemperatur Pulslängen von 40 bis 100 µs und bei 4 °C Pulslängen
von 15 bis 40 µs bewährt. Zur Optimierung der Pulsdauer sollten drei verschiedene Pulslängen innerhalb der oben-
genannten Bereiche getestet werden.
Die Elektroporation wird bei den meisten Zell-Linien mit einem Puls durchgeführt.
Wenn durch den einmaligen Puls keine ausreichende Transfektion erfolgt ist, können zwei oder mehrere Pulse zu dem
gewünschten Ergebnis führen. Dabei sollte der zeitliche Abstand zwischen den Pulsen 60 Sekunden betragen. Diese Zeit
ist notwendig für die Regeneration der Zellmembran. Der Zeitabstand wird bei der Mehrfachspulung mit dem Multiporator
®
automatisch eingehalten. Eine intakte Zellmembran ist die Voraussetzung für den Aufbau eines neuen Membran-
potentials, ohne das eine weitere Elektroporation nicht möglich ist. Ein weiterer positiver Aspekt dieser Erholungsphase ist
es, dass die Zellen rotieren können (Brown`sche Molekularbewegung) womit eine erneute "Verletzung" der gleichen
Membranzone durch einen erneuten Puls praktisch vermieden werden kann.
Voraussetzung für eine erfolgreiche Elektroporation mit dem Multiporator ® ist die Verwendung eines speziellen Puffer-
systems mit geringer elektrischer Leitfähigkeit.
Zur Erzielung optimaler Transfektionsergebnisse sollten hierzu die Originalpuffer von Eppendorf verwendet werden.
Diese Puffer sind auf Sterilität sowie auf die Abwesenheit von Mycoplasmen, Endotoxinen und Pyrogenen getestet.
Zudem unterliegen die Puffer einem ausgiebigen Zytotoxizitätstest.
Auf Wunsch kann der Anwender diese Puffer auch selbst herstellen (siehe Kapitel 7.3).
Idealerweise sollte die Elektroporation in hypoosmolarem Puffer durchgeführt werden. Durch das hypoosmolare Puffer-
system nehmen die Zellen kurz vor dem Puls Wasser auf und schwellen dadurch an. Dieser Prozess bewirkt aufgrund
verschiedener Effekte, z. B. der Erniedrigung der Durchbruchsspannung, eine erleichterte Permeabilisierung der Plasma-
membran.
3.2 Dauer des Feldpulses
3.3 Zahl der Feldpulse
3.4. Einstellung des Elektroporationspuffers
3 Optimierung der Parameter
3 Optimierung der Parameter
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 10 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14