Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 17)

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Für jede neue Zell-Linie sollten die Elektroporationsbedingungen optimiert werden. Das folgende Protokoll stellt eine
Richtlinie für die Elektroporation von eukaryotischen Zellen dar. Zur Optimierung der Elektroporationsbedingungen für
höchste Transfektionseffizienzen sollte auf das Kapitel 3 zurückgegriffen werden.
1. Die Zellen werden in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet.
2. Zellen in Kulturmedium mit 0,5 bis 1 % FCS aufnehmen, gegebenenfalls verdünnen, Zellzahl bestimmen und zentri-
fugieren.
3. Zellen in Elektroporationspuffer mit der vorher bestimmten Osmolarität bei RT oder 4 °C resuspendieren und die
Zellkonzentration auf 1 x 10 6 bis 3 x 10 6 Zellen/ml oder geringer einstellen.
Achtung: Eine erfolgreiche Elektroporation ist wesentlich davon abhängig, dass die Verweildauer im
Eppendorf Elektroporationspuffer eine Gesamtdauer von 30 Minuten nicht überschreitet.
4. Zellsuspension (400 µl bei 2 mm bzw. 800 µl bei 4mm Elektrodenabstand der Küvette) in Eppendorf-Reaktions-
gefäßen aliquotieren. Plasmid-DNA (5 bis 20 µg/ml Endkonz.) bzw. Proteine (10 bis 100 µg/ml Endkonz.) hinzufügen
und mischen.
Falls die Elektroporation bei 4 °C durchgeführt wird: Vorkühlen der Küvetten auf Eis.
5. Überführen der Elektroporationsansätze luftblasenfrei in Elektroporationsküvetten.
6. Elektroporation: (Einstellungen am Multiporator ® )
Modus: Eukaryoten
Spannung (U):
Für die Einstellung der optimalen Spannung am Multiporator ® ist es hilfreich,
eine Reihe von Vorexperimenten mit unterschiedlichen Spannungen durchzuführen.
Für adhärente Zellen: der 1- bis 5fache Wert der in Tabelle 2 angegebenen minimalen
Spannung.
Für Suspensionszellen: der 1- bis 3fache Wert der in Tabelle 2 angegebenen minimalen
Spannung.
Zeitkonstante (
τ
): bei RT 40 bis 100 µs
bei 4 °C 15 bis 40 µs
Anzahl der Pulse (n): 1
7. Zellsuspension nach dem Puls in der Küvette 5 bis 10 Minuten ruhen lassen.
Wurde die Elektroporation bei 4 °C durchgeführt, sollten die Küvetten nach dem Puls maximal 2 Minuten auf Eis
gestellt und anschließend 8 Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert werden.
8. Zellsuspension mit Pasteurpipette vorsichtig aus der Küvette entnehmen und in 3 bis 5 ml Kulturmedium kultivieren
(60 mm Kulturschale).
Bei der Entnahme der Zellsuspension ist zu beachten, dass die Aluminiumelektroden nicht beschädigt werden, so
dass Kontaminationen mit zytotoxischen Aluminiumionen vermieden werden.
Hinweis: Um den Heilungsprozess der Zellmembran nach dem Pulsen zu gewährleisten, sollten die Zellen vor einem
Zentrifugationsschritt 2 bis 3 Stunden bei 37 °C inkubiert werden.
Nach der Elektrotransfektion und dem Überführen der Zellen in Kulturmedium ist darauf zu achten, dass die Zellen unter
optimalen Bedingungen kultiviert werden und keinem Stress durch z. B. Schütteln oder längeren Transport ausgesetzt
werden.
In Abhängigkeit des Zelltyps und des eingesetzten Plasmids, kann die transiente Expression ca. 24 bis 48 Stunden nach
der Transfektion, im Einzelfall aber auch erst deutlich später, nachgewiesen werden.
4.2 Durchführung der Elektroporation
4.3 Nachbehandlung der Zellen
4.4 Nachweis der Transfektionseffizienz in den Zellen
4 Elektroporations-Protokoll
4 Elektroporations-Protokoll
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 17 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14