Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 15)

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4.1.3.2 Prüfung der Toleranz gegenüber den hypoosmolaren Bedingungen
Die Zellen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur in hypoosmolarem Elektroporationspuffer inkubiert.
Nach der Inkubation wird die Überlebensrate der Zellen durch den Einsatz von Vital-Farbstoffen bestimmt.
– Trypanblau: Blaufärbung der toten Zellen im Mikroskop.
– Propidiumiodid: Rotfärbung der toten Zellen im Fluoreszenzmikroskop
Liegt die Überlebensrate der Zellen >90 %, so kann der hypoosmolare Puffer unverdünnt für die Elektroporation einge-
setzt werden. Sind mehr als 10 % der Zellen lysiert, so muss die optimale Osmolarität des Elektroporationspuffers
bestimmt werden. Dazu werden die Zellen in einer Versuchsreihe in Puffern mit schrittweise ansteigender Osmolarität
inkubiert. Diese Puffer werden durch Mischen verschiedener Volumina von hypo- und isoosmolarem Elektroporations-
puffer hergestellt. Wir empfehlen, die Osmolarität gemäß der Tabelle 1 auszutesten.
Tabelle 1
Volumina des hypo- und isoosmolaren Elekroporationspuffers die zur Einstellung der gewünschten Osmolarität einge-
setzt werden (Endvolumen: 10 ml).
Mit Hilfe des anschließenden Vitalitätstests kann die optimale Osmolarität des Elektroporationspuffers bestimmt werden.
Die niedrigste Osmolarität, bei der eine Überlebensrate
≥ 90 % erreicht wird, sollte für die folgenden Elektroporationen
verwendet werden.
4.1.4 Bestimmung des Zelldurchmessers
Da die Zellgröße eine wesentliche Rolle bei der Parametereinstellung am Multiporator ® spielt, sollte sie nach einer Inku-
bation von 10 bis 15 Minuten im Elektroporationspuffer abgeschätzt werden. Die genaueste Messung kann mit Hilfe von
elektronischen Geräten, wie z. B. dem Coulter Counter oder dem Schärfe-CASY durchgeführt werden. Alternativ dazu
bietet sich das Abschätzen des Zelldurchmessers unter dem Mikroskop an. Dies kann durch ein Messokular geschehen
oder auch annäherungsweise mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer oder eines Mikrorasters.
Nach Abschätzung des Zelldurchmessers kann aus Tabelle 2 die minimale am Multiporator ® einzustellende Durch-
bruchsspannung abgelesen werden. Die optimale Pulsspannung für das Elektroporationsexperiment kann jedoch bei
Suspensionszellen das 2- bis 3fache und bei adhärenten Zellen das 2- bis 5fache der angegebenen Spannung betragen.
Gewünschte Osmolarität
Eppendorf
Hypoosmolarer Puffer (ml)
Eppendorf
Isoosmolarer Puffer (ml)
90 mOsmol/kg 10 0
150 mOsmol/kg 6.8 3.2
200 mOsmol/kg 4.2 5.8
250 mOsmol/kg 1.6 8.4
280 mOsmol/kg 0 10
4 Elektroporations-Protokoll
4 Elektroporations-Protokoll
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 15 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14