Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 12)

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b) Einfluss der Nukleinsäure-Reinheit
Empirische Studien haben ergeben, dass Puffersalze wie HEPES, EDTA oder auch Tris die Transfektionseffizienz teil-
weise drastisch reduzieren können. Es empfiehlt sich daher die zu transferierende Nukleinsäure in destilliertem Was-
ser zu lösen. Eventuell anfallende Verluste beim Umpuffern der DNA werden in der Regel durch die erhöhte Trans-
fektionseffizienz mehr als ausgeglichen.
Unabhängig von der Präparationsmethode sollte die DNA/RNA hochgereinigt (A
260 nm/A 280 nm ≥ 1.8) vorliegen.
Weiterhin ist es wichtig, endotoxinfreie DNA zu verwenden, da sonst eine Erhöhung der DNA-Konzentration auch
eine Zunahme des Endotoxingehalts in der Zellsuspension bedeutet.
c) Einfluss der Plasmidgröße
Auch die Größe des einzelnen, in die Zelle einzuschleusenden Moleküls beeinflusst die Transfektionseffizienz. So
können sich die optimalen Werte der Elektroporationsparameter, die für z. B. für ein bestimmtes Plasmid erarbeitet
wurden bei Verwendung eines größeren oder kleineren Plasmids deutlich verschieben.
Die Temperatur hat direkten Einfluss auf die Höhe der Durchbruchsspannung der Zellmembran sowie auf die Regenera-
tion der Membran nach der Permeabilisierung.
a) Einfluss der Temperatur auf die Durchbruchspannung der Zellmembran
Die Durchbruchsspannung liegt bei 4 °C doppelt so hoch wie bei Raumtemperatur. Daher muss die Temperatur bei
der Bestimmung der optimalen Feldstärke des Pulses unbedingt berücksichtigt werden. So verdoppelt sich bei einer
Elektroporation bei 4 °C auch die notwendige Feldstärke des Pulses gegenüber den bei Raumtemperatur ermittelten
Werten.
b) Einfluss der Temperatur auf die Regeneration der Zellmembran
Eine Inkubation der Zellen nach der Elektroporation bei niedrigen Temperaturen (z. B. 4 °C) verlangsamt den Hei-
lungsprozess der Zellmembran. Das Verschließen (resealing) der Membranporen kann bei eukaryotischen Zellen
unter diesen Bedingungen bis zu 1/2 Stunde und länger andauern. Dies kann bei manchen Zelltypen zu einer gestei-
gerten Aufnahme des zu transferierenden Materials führen. Einige Zellspezies reagieren jedoch besonders im per-
meabilisierten Zustand empfindlich auf tiefe Temperaturen und können schon nach kurzer Inkubationszeit in der Kälte
irreversible Schädigungen erfahren. Bei Elektroporationsexperimenten, die bei 4 °C zu hohen Transfektionsraten führ-
ten, kann die Überlebensfähigkeit der Zellen gesteigert werden, indem man sie zunächst in Elektroporationspuffer bei
37 °C oder bei Raumtemperatur resuspendiert, sie anschließend auf 4 °C abgekühlt und dann in vorgekühlte Küvet-
ten transferiert. Nach der Elektroporation werden die Zellen noch kurz (max. 2 min) bei 4 °C inkubiert, bevor sie auf
37 °C erwärmt werden.
Eine Elektroporation bei höheren Temperaturen (z. B. >25 °C) führt zu einem schnelleren Verschluss der permeabili-
sierten Membranbereiche. Dies beschleunigt die Regeneration der Membran, wodurch die Überlebensrate der Zellen
erhöht werden kann. Andererseits kann die Transfektionsrate geringer sein als bei einer Elektroporation mit niedrigen
Temperaturen.
c) Einfluss der Temperatur auf die Leitfähigkeit des Mediums
Die Temperatur beeinflusst beträchtlich die Leitfähigkeit des Elektroporationspuffers. Mit einer Erhöhung der Tempe-
ratur nimmt auch die Leitfähigkeit einer Lösung zu. Dies kann zu verringerten Transfektionsraten führen. Aus diesem
Grund sollte nicht bei Temperaturen über 33 °C gearbeitet werden.
3.6 Einfluss der Temperatur
3 Optimierung der Parameter
3 Optimierung der Parameter
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 12 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14