Eppendorf Multiporator - Electroporation Benutzerhandbuch
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1
Einleitung
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1.1
Grundsätzliches zu der Applikationsanleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2
Prinzip des Multiporators
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3
Optimierung der Parameter
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3.1
Optimierung der Feldstärke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.2
Dauer des Feldpulses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.3
Zahl der Feldpulse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.4.
Einstellung des Elektroporationspuffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.5
Einfluss der DNA/RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3.6
Einfluss der Temperatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3.7
Einfluss der Zelldichte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
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Elektroporations-Protokoll
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4.1
Vorbereitung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.1.1
Mycoplasmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.1.2
Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.1.3
Einstellen der Osmolarität des Elektroporationspuffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.1.3.1
Ablösen adhärenter Zellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.1.3.2
Prüfung der Toleranz gegenüber den hypoosmolaren Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.1.4
Bestimmung des Zelldurchmessers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.1.5
Präparation der DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
4.1.6
Auswahl der Temperatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
4.2
Durchführung der Elektroporation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.3
Nachbehandlung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.4
Nachweis der Transfektionseffizienz in den Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
5
Fehlersuche
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6
Bestellinformationen
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7
Anhang
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7.1
Hilfsmittel zur Bestimmung der Mindestspannung, die am Multiporator
®
einzustellen ist . . . . . . . . . . . . . . . 23
7.2
Volumina des Hypo- und Isoosmolaren Puffers zur Einstellung der gewünschten Osmolarität (10 ml) . . . . . 24
7.3
Zusammensetzung der Puffer für die Elektroporation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
7.4
Protokoll für die Elektroporation von eukaryotischen Zellen am Beispiel Jurkat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Inhaltsverzeichnis
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