Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 9)

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Zur Erzielung maximaler Transfektionsraten sollten die Elektroporationsbedingungen für jede Zell-Linie optimiert werden.
Im Folgenden finden Sie Richtlinien, nach denen die optimalen Parameter einfach und zeitsparend ermittelt werden
können.
Die Feldstärke (V/cm) des eingesetzten elektrischen Pulses bestimmt maßgeblich sowohl die Überlebensrate als auch
die Transfektionsrate der eingesetzten Zellen.
Überschreitet die Feldstärke des Pulses einen charakteristischen Grenzwert (= kritische externe Feldstärke), so erfolgt
ein reversibler Durchbruch in der Zellmembran. Diese sogenannte Durchbruchspannung ist im Wesentlichen abhängig
vom Durchmesser der Zelle und der Temperatur, bei der die Elektroporation erfolgt. In den Diagrammen in Abb. 2 ist die
Durchbruchsspannung in Abhängigkeit des Zelldurchmessers und der Temperatur graphisch dargestellt. Der Zelldurch-
messer wird jeweils nach 10-15–minütiger Inkubation der Zellen im Elektroporationspuffer bestimmt (siehe Kapitel 3.4 +
7.1).
Bei der Bestimmung der minimalen Pulsspannung muss auch der Elektrodenabstand in der Küvette berücksichtigt wer-
den. Bei einer Verdoppelung des Elektrodenabstands muss auch die Pulsspannung verdoppelt werden, um die gleiche
Feldstärke zu erzielen. Bei der Bestimmung der optimalen Feldstärke gilt die Regel, dass bei kleineren Zellen höhere
Feldstärken eingesetzt werden müssen, um einen Membrandurchbruch zu erreichen. Die aus Abb. 2 sowie aus Tabelle 2
(Seite 16) ablesbaren Durchbruchsspannungen stellen die minimalen Werte dar, bei denen ein Durchbruch der Membran
erfolgen kann. Die optimale Transfektionseffizienz wird jedoch in Abhängigkeit vom verwendeten Zelltyp oft erst bei sehr
viel höheren Spannungen erreicht. Zur Bestimmung der optimalen Pulsspannung sollte daher in einer Versuchsreihe der
1-, 2- und 3fache Wert für Suspensionszellen und der bis zu 5fache Wert für adhärente Zellen aus Tabelle 2 (Seite 16) ver-
wendet werden. Zellen, die im Elektroporationspuffer keine kugelige Form annehmen, benötigen für eine optimale Trans-
fektion teilweise noch höhere Pulsspannungen.
Grundsätzlich gilt: Eine Erhöhung der Pulsspannung kann zu einer erhöhten Transfektionsrate, jedoch gleichzeitig auch
zu einer erhöhten Zellsterblichkeit führen.
Abb. 2: Minimale Pulsspannung für den Durchbruch der Zellmembran
3.1 Optimierung der Feldstärke
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
0 20 40 60 80 100
4 °C
RT
Küvette: 2 mm Elektrodenabstand
400 µl Volumen
Spannung in V
Durchmesser der Zelle in µm
0
4 0 0
8 0 0
1 2 0 0
1 6 0 0
2 0 0 0
2 4 0 0
2 8 0 0
0 20 40 60 80 100
4 °C
RT
Küvette: 4 mm Elektrodenabstand
800 µl Volumen
Spannung in V
Durchmesser der Zelle in µm
3 Optimierung der Parameter
3 Optimierung der Parameter
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 9 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14