Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 18)

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Sollten die Transfektionsexperimente nicht zu dem gewünschten Ergebnis führen, kann die folgende “Fehlersuche“ als
Hilfestellung zur Behebung des Problems verwendet werden.
Die aufgezeigten spezifischen Probleme können durch eine Vielzahl von Faktoren verursacht werden. Diese kann der
Anwender leicht ausschließen, wenn er die einzelnen Schritte mit Hilfe der Lösungsvorschläge oder unter zu Hilfenahme
der Kapitel 3 und 4 optimiert.
Problem Mögliche Ursache Abhilfe und Kommentare
Niedrige Überlebensrate Zu starker Puls Überprüfen Sie die Bestimmung der Zellgröße
(Kapitel 4.1.4 ) und die darauf basierende
Bestimmung der minimalen Feldstärke
(Tabelle 2). Bedenken Sie, dass auch die Spalt-
breite der Küvette und die Temperatur bei der
Bestimmung der Pulsspannung berücksichtigt
werden müssen.
Zu langer Puls Eine Verkürzung der Pulsdauer führt zu einer
verringerten Permeation der Zellmembran und
kann daher die Überlebensrate der Zellen erhö-
hen. Bedenken Sie, dass die optimale Pulslänge
durch die Temperatur, bei der die Elektropora-
tion durchgeführt wird, beeinflusst wird
(Kapitel 3.6).
Zu viele Pulse Verringern Sie die Anzahl der Pulse. Eine mehr-
fache Permeabilisierung der gleichen Membran-
bereiche kann zu irreversiblen Schädigungen
der Plasmamenbran führen.
Verwendung eines Elektro-
porationspuffers mit zu hoher
Leitfähigkeit Überprüfen Sie die Leitfähigkeit Ihres Elektro-
porationspuffers mit einem Messgerät. Die Ver-
wendung von Puffern mit einer Leitfähigkeit
>4 mS/cm kann zu einer verminderten Einbau-
rate führen. Wir empfehlen daher die Verwen-
dung der original Eppendorf Elektroporations-
puffer. Auch die Zugabe der Plasmid-DNA kann,
falls sie nicht in Wasser sondern in Puffer gelöst
wurde, die Leitfähigkeit deutlich erhöhen.
Zu lange Verweildauer der
Zellen im Elektroporationspuffer Überschreitet die Gesamtverweildauer der Zel-
len im Elektroporationspuffer 30 Minuten, kann
bei einigen Zelltarten Apoptose eingeleitet wer-
den. Verkürzen Sie das Experiment, z. B. durch
eine raschere Durchführung der Einzelschritte,
durch eine kürzere Waschprozedur vor dem
Puls oder durch kürzere Inkubationszeiten der
Zellen nach dem Puls. (Achtung: Eine Inkuba-
tionszeit von 5 bis 10 Minuten bei Raumtempe-
ratur sollte eingehalten werden, damit die Zell-
membran sich wieder schließen kann. Anschlie-
ßend können die Zellen in Kulturmedium über-
tragen und bei 37 °C kultiviert werden). Um den
Heilungsprozess der Zellmembran nach dem
Pulsen zu gewährleisten, sollten die Zellen vor
einem Zentrifugationsschritt 2 bis 3 Stunden bei
37 °C inkubiert werden.
5 Fehlersuche
5 Fehlersuche
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 18 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14