Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 20)

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Puls zu kurz Eine Verlängerung der Pulsdauer kann die Per-
meabilität der Zellmembran erhöhen und zu
einer höheren Transfektionsrate führen. Dabei
ist zu beachten, dass die optimale Pulsdauer
durch die Temperatur, bei der die Elektropora-
tion durchgeführt wird, beeinflusst wird.
DNA-Konzentration
zu gering / zu hoch Ist die Transfektionseffizienz sehr niedrig und
die Vitalität der Zellen hoch, sollte die Plasmid-
konzentration erhöht werden.
Es ist jedoch zu beachten, dass eine Erhöhung
der Plasmidkonzentration nur innerhalb eines
begrenzten Konzentrationsbereichs auch eine
erhöhte Transfektionseffizienz zur Folge hat.
Verwendung großer
Plasmide Die Größe des Plasmids kann die Transfektions-
rate erheblich beeinflussen. Bei Einsatz großer
Plasmide kann es notwendig sein, durch Einsatz
von Pulsen höherer Feldstärke die Permeabili-
sierung der Membran zu erhöhen. Dies kann
jedoch auch zu größeren Schäden in den Zell-
membranen und damit zum Absterben von Zel-
len führen.
Zu hohe Zelldichte Bei zu hohen Zelldichten während der Elektro-
poration kann die Homogenität des elektrischen
Feldes nicht mehr gewährleistet werden. Redu-
zieren Sie die Zellkonzentration in der Küvette
auf 1 – 3 x 10
6 Zellen/ml oder geringer.
EDTA oder Endotoxine
im Elektroporationansatz EDTA und Endotoxine wirken zytotoxisch. Sie
werden häufig durch die zugesetzte DNA, die
z. B. in TE-Puffer gelöst ist, in den Elektropora-
tionsansatz eingebracht. Puffern Sie zur Entfer-
nung von EDTA die DNA auf H
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O (bidest. steril)
um. Endotoxine können über endotoxinfreie
Plasmidpräparationskits entfernt werden.
Zu kurze Inkubationszeit
für die Genexpression Unterschiedliche Zelltypen benötigen nach der
Transfektion unterschiedliche Inkubationszeiten,
um ihre maximale Expressionsrate zu erreichen.
Die Expression sollte deshalb nach einigen Zeit-
intervallen wiederholt überprüft werden.
Probleme mit dem Reporter
System Zur Überprüfung der Funktion des Reporter-
systems sollten parallel positive Kontrollen
durchgeführt werden.
Nicht reproduzierbare
Ergebnisse Die Waschprozedur vor
der Elektroporation war
nicht sorgfältig genug Spuren von Medium können die Leitfähigkeit
des Elektroporationspuffers und damit auch
das Transfektionsergebnis erheblich beeinträch-
tigen. Daher sollte bei der Waschprozedur das
Medium aus dem Überstand sorgfältig entfernt
werden.
Problem Mögliche Ursache Abhilfe und Kommentare
5 Fehlersuche
5 Fehlersuche
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 20 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14