Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 14)

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Zellspezifische Applikationsprotokolle sind auf der Eppendorf Homepage www.eppendorf.com abrufbar. Die Liste dieser
Applikationen wird ständig erweitert. (Ein Beispielprotokoll für Jurkat-Zellen befindet sich im Anhang 7.4).
Steht für den zu untersuchenden Zelltyp kein Applikationsprotokoll zur Verfügung, kann die folgende allgemeine
Anleitung zur Elektroporation eukaryotischer Zellen verwendet werden.
Zur Erzielung bester Transfektionsergebnisse empfehlen wir, die optimalen Parameter der Elektroporation im Experiment
zu ermitteln. Weitergehende Hinweise zur Optimierung der Parameter finden Sie im Kapitel 3 “Optimierung der Elektro-
porationsparameter“.
4.1.1 Mycoplasmen
Mycoplasmen verhindern eine effiziente und reproduzierbare Elektroporation der Zellen. Daher müssen die verwendeten
Zellen unbedingt auf Mycoplasmen getestet sein. Hierzu sind mehrere Testverfahren erhältlich.
Eine häufig verwendete Methode ist der Mycoplasmentest mittels der DNA-Fluorochromfärbung. Dieser Test beruht auf
der DNA-Färbung mit dem Hoechst-Farbstoff 33258 oder DAPI, wodurch die Mycoplasmen-spezifische DNA im
Fluoreszenzmikroskop sichtbar wird.
Die derzeit empfindlichste Nachweismethode für Mycoplasmen erfolgt mit Hilfe der PCR. Nachweiskits auf Basis der
PCR sind kommerziell erhältlich, sie erfordern jedoch einen höheren Zeitaufwand und sind mit höheren Kosten
verbunden als die vorher genannten Methoden.
4.1.2 Zellkultur
Die Zellen sollten vor der Elektroporation mehrfach passagiert worden sein. Es sollten keine frisch aufgetauten oder kurz
vorher transportierten Zellen verwendet werden, da der zusätzliche Stress die Transfektionsrate negativ beeinflussen
kann.
Zur Elektroporation sollten die Zellen so umgesetzt werden, dass sie sich zum Zeitpunkt der Transfektion in der
exponentiellen Wachstumsphase befinden.
4.1.3 Einstellen der Osmolarität des Elektroporationspuffers
Die Elektroporation mit dem Multiporator ® sollte idealerweise in hypoosmolarem Elektroporationspuffer durchgeführt
werden. Die Toleranz der Zellen gegenüber dem hypoosmolaren Elektroporationspuffer muss in einem Vorexperiment
getestet werden (siehe auch Kapitel 3.4).
4.1.3.1 Ablösen adhärenter Zellen
Das Ablösen der Zellen vom Kulturgefäß sollte möglichst schonend erfolgen. Je nach Zelltyp können
z. B. folgende Methoden verwendet werden:
• Dispase (Konzentration 0,01 bis 0,1 % w/v). Dies hat sich als die schonendste Methode zur Ablösung
der Zellen erwiesen.
• Trypsin (HPLC-grade, ohne EDTA) 0,1 bis 0,25 % (w/v). Die Zellen müssen vor der Verwendung von Trypsin
mindestens 2-mal mit PBS ohne Ca
2+ und Mg 2+ gewaschen werden.
• Zellen vorsichtig vom Boden der Kulturschale abschaben.
4.1 Vorbereitung der Zellen
4 Elektroporations-Protokoll
4 Elektroporations-Protokoll
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 14 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14