Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 8)

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Berechnung der Feldstärke
Die kritische Feldstärke, die erforderlich ist, um den elektrischen Durchbruch der Membran herbeizuführen, kann nähe-
rungsweise berechnet werden. Dazu muss der ungefähre Durchmesser (d) der Zelle bestimmt werden. Damit lässt sich
nach folgender Formel die kritische Feldstärke berechnen:
E
c
= V
c
/ (0,75 x d)
E
c
kritsche Feldstärke [V / cm]
V
c
Durchbruchspannung der Membran (1 V bei 20 °C und etwa 2 V bei 4 °C)
d Zelldurchmesser in [cm]
Hier nun ein Rechenbeispiel für eine Zelle mit einem Durchmesser von 20 µm (2 x 10 -3 cm) bei Raumtemperatur:
E
c
= 1 V / (0,75 x 2 x10 -3 cm)
E
c
= 667 V/cm
Um die erforderliche Spannung, die am Multiporator ® einzustellen ist, zu berechnen, muss der Wert der Feldstärke E
c
lediglich mit dem Elektrodenabstand der Küvette multipliziert werden. In unserem Beispiel muss für eine 2 mm Küvette
also eine Mindestspannung von 667 V/cm x 0,2 cm = 133 V eingestellt werden. Für eine 4 mm Küvette ergibt sich der
doppelte Wert von 667 V/cm x 0,4 cm = 267 V.
Wird die Elektroporation bei 4 °C durchgeführt, ist der Wert von E
c
wegen (V
c
= 2 V bei 4 °C) doppelt so groß wie bei
Raumtemperatur.
Bei der kritischen Feldstärke E
c
entstehen die ersten in Feldrichtung angeordneten "Poren" in der Membran, durch die
kleine Moleküle oder Ionen passieren können. Eine Überprüfung der "Porenbildung" ist mit Propidumiodid sofort mög-
lich. Die rote Fluoreszenz dieses Farbstoffs kann nach dem Eindringen in die Zelle und nach der Bindung an Nukleinsäu-
remoleküle nachgewiesen werden. Für große Moleküle wie Nukleinsäuren muss jedoch mit höheren Feldstärken als der
berechneten gearbeitet werden. Bei Suspensionszellen ist in der Regel das 1- bis 3fache von E
c
der ideale Wert, um
Plasmid-DNA in die Zelle zu bringen. Bei adhärent wachsenden Zellen sollte der 1- bis 5fache Wert von E
c
angewendet
werden, um erfolgreich DNA in die Zelle einzuschleusen.
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Dauer des Soft Pulses
Für die schonende und hoch effiziente Elektroporation ist – wie oben erwähnt – ein Puls im Mikrosekundenbereich opti-
mal. Generell lässt sich feststellen, dass große Zellen längere Zeiten benötigen, bis es zu einem reversiblen Membran-
durchbruch kommt. In der Regel werden mit dem Multiporator
® Pulse mit einer Zeitkonstanten zwischen 5 µs und maxi-
mal 100 µs zur Elektroporation verwendet. Diese Zeiten sind optimal mit dem Puffersystem des Multiporators abge-
stimmt.
Eine Optimierungsstrategie für neue Applikationen bezüglich aller relevanten Parameter (Feldstärke, Pulsdauer usw.) wird
im folgenden Kapitel ausführlich dargestellt.
Literaturangaben
1) Sukhorukov, V.L., Mussauer, H. and Zimmermann, U. (1998) The effect of electrical deformation forces on the
electropermeabilisation of erythrocyte membranes in low- and high conductivity media. J.Membr. Biol. 163, 235-245.
2) Friedrich, U., Stachowicz, N., Simm, A., Fuhr, G., Lucas, K. and Zimmermann, U. (1998) High efficiency electrotrans-
fection with aluminium electrodes using microsecond controlled pulses.
Bioelectrochemistry and Bioenergetics 47, 103-111.
2 Prinzip des Multiporators
2 Prinzip des Multiporators
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 8 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14