Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 11)

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Bei den meisten Zelltypen hat die experimentell bedingte 20- bis 30-minütige Inkubation in hypoosmolaren Bedingungen
keinen Einfluss auf die Vitalität. Besonders empfindliche Zellen können jedoch durch die Inkubation in hypoosmolarem
Puffer unter Umständen eine Apoptose einleiten oder sogar lysieren. Die Toleranz der Zellen gegenüber den hypoosmo-
laren Bedingungen sollte daher grundsätzlich getestet werden. Dies geschieht am einfachsten durch eine 30-minütige
Inkubation der Zellen in hypoosmolarem Puffer und eine anschließende Vitalitätsfärbung durch Trypanblau oder Propidi-
umiodid. Sind nach mikroskopischer Betrachtung mehr als 10 % der Zellen lysiert, muss die Osmolarität des Puffers
durch Zusatz von isoosmolarem Puffer erhöht werden. Es empfiehlt sich zur Ermittlung der optimalen Osmolarität, die
Zellen vor dem Experiment in verschiedenen Mischungsverhältnissen von hypo- und isoosmolarem Puffer 30 Minuten zu
inkubieren (siehe Tabelle 1, Seite 13). Diese Zeit entspricht der maximalen Verweildauer der Zellen im Elektroporations-
Puffersystem. Über einen erneuten Vitalitätstest und unter anschließender mikroskopischer Betrachtung kann die Osmo-
larität bestimmt werden, die von den Zellen noch toleriert wird. Das ermittelte Mischungsverhältnis kann dann für alle fol-
genden Experimente mit diesem Zelltyp verwendet werden.
Unabhängig von der Wahl des Puffersystems sollte unbedingt darauf geachtet werden, dass die Gesamtverweildauer der
Zellen im Elektroporationspuffer 30 Minuten nicht überschreitet.
Die Transfektionseffizienz der Elektroporation kann durch die Konzentration, die Reinheit und die Größe der einzusetzen-
den Moleküle beeinflusst werden.
a) Einfluss der Nukleinsäure-Konzentration
Bei optimalen Elektroporations-Parametern (Osmolarität, Spannung, Pulsdauer) werden befriedigende bis sehr gute
Ergebnisse mit Plasmidkonzentrationen zwischen 5 µg/ml und 20 µg/ml erzielt.
Die Effizienz der Transfektion lässt sich in einem begrenzten Bereich durch eine Erhöhung der Nukleinsäurekonzen-
tration steigern. Untersuchungen mit verschiedenen Zell-Linien haben gezeigt, dass nur in Ausnahmefällen (große
Plasmide) Konzentrationen von mehr als 20 µg/ml zu einer Steigerung der Transkfektionsrate führen (siehe Abb. 3).
Abb. 3: Transiente Transfektionseffizienz in NIH-3T3-Zellen in Abhängigkeit der DNA-Konzentration (µg/ml).
Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des Plasmids pEGFP-N1 elektroporiert.
Die Transfektionsraten (max = 100 %) wurden mit Hilfe der FACS-Analyse bestimmt.
3.5 Einfluss der DNA/RNA
Plasmid-DNA [µg/ml]
T
ransiente EGFP-N1 Expr
ession [%]
0
50
100
0 10 20 30 40
3 Optimierung der Parameter
3 Optimierung der Parameter
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 11 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14