Eppendorf Multiporator - Electroporation - Handbuch (Seite 5)

5
Das Elektroporationsverfahren, das unter Verwendung des Multiporators möglich ist, unterscheidet sich grundsätzlich
von allen anderen kommerziellen Geräten. Die wesentlichen Unterschiede sind:
– Applikation von extrem kurzen Pulsen im Bereich von 15 bis 100 Mikrosekunden gegenüber Pulsen im
Millisekundenbereich.
– Elektronische Regelung der applizierten Pulse. Sie ermöglicht uniforme reproduzierbare Pulse, die unabhängig von
den Widerstandseigenschaften des Mediums sind.
– Elektroporation in hypoosmolaren Lösungen, die nicht toxisch sind und die gegenüber den herkömmlichen isoosmo-
len Puffern an das innere Ionenmilieu der Zellen adaptiert sind.
Die Kombination dieser Eigenschaften führt zu hohen Transfektionsausbeuten, ohne dass es zu einer ernsthaften
Zellschädigung kommt, wie es bei der Elektroporation im Millisekundenbereich sehr häufig beobachtet wird.
Soft Pulse
Bei der Elektroporation wird die Membran einer Zelle elektrisch bis auf einen Spannungswert aufgeladen, bei der die
Zellmembran (reversibel) durchbricht. Die beim Multiporator
® üblicherweise verwendeten Pulslängen (d. h. die Zeitkon-
stanten
τ
) liegen zwischen 15 µs und 100 µs für pflanzliche und tierische Zellen. In diesem Zeitraum kommt es zu einem
Membrandurchbruch, wenn die Durchbruchspannung überschritten wird. Der Durchbruch der Membran führt zu einem
drastischen Anstieg der Permeabilität der Membran, den man sich durch die Bildung von Poren in der Membran vorstel-
len kann.
Wenn in dieser Phase der Elektroporation die externe Spannung bis zu tausendfach länger anliegt (wie das bei Millise-
kunden der Fall ist), wird die Zelle massiv geschädigt, da hohe elektrische Ströme durch das Zellinnere fließen. Diese
Ströme können zu einer irreversiblen Schädigung der Membranfunktionen und des Genoms sowie zu einer irreversiblen
Änderung des Ionenmilieus in den gepulsten Zellen führen. Diese Situation ist bei vielen herkömmlichen Elektropora-
tionsgeräten gegeben.
Im Gegensatz hierzu wird bei der Applikation der Soft Pulse des Multiporators die Zelle praktisch nur soweit aufgeladen,
bis der Durchbruch stattfindet. Der exponentiell abfallende (elektronisch geregelte) Puls verhindert, dass nach der
Entstehung der "Poren" noch nennenswerte Ströme durch die gepulsten Zellen fließen können.
Weiterhin wird der Soft Pulse vom Multiporator ® kontinuierlich gemessen und alle 5 µs neu reguliert. Diese einzigartige
elektronische Steuerung ermöglicht eine sehr hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
Hierin liegt eine der Ursachen für die sehr hohe Transfektionsrate des Multiporators.
Multiporator ® -Puffersystem
Durch die Verwendung von Pulsmedien geringer elektrischer Leitfähigkeit fließt während der Elektroporation deutlich
weniger Strom, so dass keine nennenswerte Zellschädigung auftritt. Gleichzeitig wird durch die Verwendung dieser
Pulsmedien erreicht, dass die elektrisch induzierten "Poren" sehr viel größer sind als bei Pulsapplikationen in leitenden
Lösungen, wie z. B. in Phosphat-gepufferten Kochsalzlösungen (1).
Der Multiporator ® ist speziell auf den Einsatz solcher Pulsmedien ausgelegt.
pH-Verschiebungen
Bei lang anhaltendem Stromfluss setzt außerdem an den Elektroden der Küvette die Elektrolyse von Wasser ein. Dadurch
treten bei den häufig verwendeten Millisekunden-Pulsen extreme pH-Veränderungen in unmittelbarer Umgebung der
Elektroden auf. pH-Verschiebungen in den stark basischen und in den sauren Bereich sind unphysiologisch und schä-
digen die Zellen. Bei der Verwendung des Multiporators konnten dagegen keine nennenswerten pH-Veränderungen an
den Elektroden nachgewiesen werden (2).
2 Prinzip des Multiporators
2 Prinzip des Multiporators
Multipor_Appli_E_poration_de.fm Seite 5 Montag, 30. Januar 2006 2:16 14